pPICHOLI載體可以讓異源基因在P. pastoris中表達(dá)，同時(shí)也能在原核的E.coli中表達(dá)。這個(gè)載體包含可誘導(dǎo)（酵母）的乙醇脫氫酶（AOX）啟動(dòng)子和E.coli T7啟動(dòng)子，這樣就允許它可以在P. pastoris和E.coli中自主復(fù)制。因此，載體的線性化就不再是必需的了，而且，少量的DNA就可成功的轉(zhuǎn)化P. pastoris。

由于PARS序列被整合到載體中，使從酵母中提取的質(zhì)粒非常簡單的實(shí)現(xiàn)復(fù)原。不需要將亞克隆轉(zhuǎn)入一系列表達(dá)載體中，也不需對陽性菌株進(jìn)行檢測，而多克隆位點(diǎn)又使DNA片段很方便的連接到載體中。

特點(diǎn)：

1.       原核表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)易于操作、花費(fèi)少，并且可得到高水平異源蛋白產(chǎn)物；

2.       P. pastoris/pPICHOLI 系統(tǒng)是一個(gè)強(qiáng)有力的真核表達(dá)系統(tǒng)，由于結(jié)合了AOX或CUP1啟動(dòng)子，使其可以快速生長。

3.       適合表達(dá)翻譯后修飾的可溶性蛋白和不適宜在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白（真核）（例如一些毒素蛋白）；

4.       容易克隆和高的轉(zhuǎn)化效率；

5.       方便的親和純化和重組蛋白的檢測。

The pPICHOLI vectors

pPICHOLI載體

穿梭表達(dá)載體pPICHOLI和pPICHOLI-HA結(jié)合了真核和原核啟動(dòng)子元件。噬菌體T7啟動(dòng)子，含有主要衣殼蛋白的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)菌的表達(dá)，它被放在P. pastoris啟動(dòng)子的下游。強(qiáng)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子（AOX）是被緊緊調(diào)控的，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中，蛋白表達(dá)是完全被抑制的，而生長在甲醇中，則可被最大限度的誘導(dǎo)。

pPICHOLI-1（3579bp）有兩個(gè)G bases直接位于Sal位點(diǎn)的上游，pPICHOLI-2（3578bp）和pPICHOLI-3（3577bp）分別敲除一個(gè)和兩個(gè)G bases。

pPICHOLI-HA載體含有一個(gè)HA（血球凝集素）抗原決定簇代替了生物素酰化序列。

pPICHOLI-C加進(jìn)了釀酒酵母CUP1   啟動(dòng)子（代替了AOX啟動(dòng)子）。這個(gè)載體沒有T7啟動(dòng)子，不適合原核蛋白的表達(dá)。

由于使用了共同的選擇標(biāo)記zeocin，這個(gè)穿梭載體仍然是小的（~3.6和3.2kb），因此，操作、克隆和轉(zhuǎn)化都很方便。通過將Pichia特異的自主復(fù)制序列（PARS1）整合到pPICHOLI載體中，線性化不再是必需的，轉(zhuǎn)化效率增加到10⁵轉(zhuǎn)化體/ug DNA。pPICHOLI雙重表達(dá)載體包括一個(gè)RGS（His）6tag和一個(gè)生物素化序列，這樣就使表達(dá)蛋白易于檢測和快速的純化。