1、準(zhǔn)備：首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。一般來說每次滅菌前都應(yīng)該加水。加水不能太少，否則會引起燒干或者爆裂。加水最好加去離子水或蒸餾水，這樣產(chǎn)生的水垢少些，而且鍋體不容易被腐蝕。
　　2、放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。將準(zhǔn)備滅菌的培養(yǎng)基及空玻璃器皿用牛皮紙包好，裝入鍋內(nèi)套層中，物品放置不宜過多，過擠，鍋內(nèi)應(yīng)留出三分之一空間。以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
　　3、加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。然后蓋嚴(yán)鍋蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。
　　4、用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間（在溫度或者壓力達(dá)到所需時，一般為121℃，0.1MPa）需要切斷電源），停止加熱。當(dāng)溫度下降時，再開啟電源開始加熱，使溫度維持在恒定的范圍之內(nèi)。因為溫度太低達(dá)不到滅菌效果，太高可能會出危險。現(xiàn)在市場上手提滅菌鍋實現(xiàn)了控制自動化，不過因為滅菌壓力比較大，最好還是有人在現(xiàn)場比較保險）。
　　5、滅菌所需時間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，10分鐘后取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的液體由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。

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