透射電鏡實(shí)驗(yàn)技術(shù)

透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)和成像原理透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)包括兩大部分：主體部分為照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察照相室；輔助部分為真空系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)。

透射電鏡的應(yīng)用：
透射電子顯微鏡在材料科學(xué)、生物學(xué)上應(yīng)用較多。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會(huì)影響到最后的成像質(zhì)量，必須制備更薄的超薄切片，通常為50～100nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時(shí)的樣品需要處理得很薄。
常用的方法：超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍蝕刻法、冷凍斷裂法等。對(duì)于液體樣品，通常是掛預(yù)處理過(guò)的銅網(wǎng)上進(jìn)行觀察。
樣本制備方法：
由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
   在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過(guò)程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過(guò)取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。一. 取材的基本要求組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài)，必須做到快、小、準(zhǔn)、冷：
(1)．動(dòng)作迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時(shí)間內(nèi) (爭(zhēng)取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取組織的體積要小，一般不超過(guò)1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。
(3)．機(jī)械損傷要小，解剖器械應(yīng)鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。
(4)．操作最好在低溫(0℃～4℃)下進(jìn)行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。
(5)．取材部位要準(zhǔn)確。取材方法：將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應(yīng)先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。
二．固定
固定的目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們?cè)瓉?lái)所在的位置上。固定的方法有物理的和化學(xué)的兩大類。物理的方法系采用冰凍、干燥等手段來(lái)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；化學(xué)的方法是用一定的化學(xué)試劑來(lái)固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)通常使用化學(xué)方法對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定。
常用固定劑：
1、四氧化鋨 (osmium tetroxide，)是一種強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時(shí)間一般為1-2小時(shí)。
2．戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)，戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長(zhǎng)時(shí)間的固定(幾周甚至1～2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆。
缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒(méi)有電子染色作用，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。
組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分預(yù)固定和后固定，中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時(shí)以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～2小時(shí)，pH7.3～7.4。
固定完畢，用緩沖液漂洗20分鐘后進(jìn)行脫水。
(一) 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)冷凍割斷法
1．取材和固定：為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，不被過(guò)多的血細(xì)胞污染，可在取材前用灌注法沖洗。即先將動(dòng)物麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開(kāi)下腔靜脈放血，至無(wú)血色為止。然后迅速取材，將樣品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%鋨酸溶液中固定1小時(shí)，用1/15M磷酸緩沖液 (pH7.4)清洗兩次，每次10分鐘。
2．二甲基亞 浸泡：將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中，各浸泡30分鐘。
3．割斷：用TF—1型冷凍割斷裝置進(jìn)行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中，等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗，每次10分鐘，換液5次。
4．軟化及后固定：將樣品放入0.1%鋨酸中軟化，溫度20(C，時(shí)間48～72小時(shí)。然后用1% 八 固定1小時(shí)，雙蒸水浸洗1小時(shí)，換液幾次，需徹底清洗干凈。
5．導(dǎo)電染色：將樣品放入2%丹寧酸中2小時(shí)(或過(guò)夜)，以雙蒸水清洗1小時(shí)，換液幾次。再以1% 八 固定30～60分鐘，雙蒸水清洗1小時(shí)。
6．脫水、干燥及鍍膜：按常規(guī)方法進(jìn)行。

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